qPCR based CCS比 aCGH更準確 !! ​ ​ CCS胚胎染色體的 ​​ 全基因檢測6種PGS 平台 大PK:FISH CGH aCGH qPCR SNP NGS :qPCR based CCS比 aCGH更準確 !! 全世界第一例試管嬰兒在1978年誕生叫路 ​意 ​絲 布朗， 但事實上在更早1967年艾德華就用兔子的胚胎去做公兔、母兔 ​的性別​ PGD， 這個實驗還比試管嬰兒提早了11年， 試管嬰兒也2010年得到諾貝爾醫學獎， 公認 ​試管嬰兒​ 成就比入類登陸月球還大， 但我們面臨的是 ​女人​ 隨著年紀的增加，胚胎或卵子的染色體異常比率會增加，尤其是 ​女人​ 超過35歲以後， ​染色體 3套體比率像沖天炮一樣沖到35%以上， 這個研究證實年紀愈大胚胎3套體的比率會增加， 美國CDC的統計也發現年紀超過35歲以上，試管嬰兒成功率活產率也愈來愈低，尤其是超過42歲幾乎是 ​個 位數，這是2010年的統計。 從2001年到2010年美國這10年來植入胚胎數， ​統計​ 從 ​植入胚胎​ 1個、2個、3個或4個以上，尤其是植入4個胚胎或超過4個，從 ​2001年的​ 12%降到 ​2010年的​ 1%， 可見美國在沒有人工生殖法的限制下，即便是在2010年， ​仍然有​ 1% ​(1600個)​ ​植入​ 4個胚胎以上， ​美國1年16萬次試管嬰兒，​ 6% ​植入​ 3個胚胎， 75% ​植入​ 2個胚胎， ​植入​ 單一胚胎只有19%， 因為胚胎植入數增加，使得新生兒合併症 ​：​ 早產或低體重 ​單 胞胎是11.7%， 雙胞胎是59.4%， ​三 胞胎高達96.1%會早產。 在2007年(民國96年)之前人類對於胚胎染色體篩檢檢查， 那一年美國生殖醫學會指導綱領提出目前的醫學證據不 ​支持 例行性的使用PGS， 這是 ​2007 年的事情， 那時候是第3天切片使用FISH， 那一年也提出了叫做 ​有名的：​ 莫生布魯克爭議， 其中最主要的是第三天胚胎會減少懷孕率， 但是這7年當中變化太大，如2008年的基因晶片a-CGH， 2009年Simon Fishel ​費雪​ 第1例 ​a​ CGH寶寶誕生， 美國紐澤西團隊在2010年使用SNP，冷凍胚胎獲得驚人的 ​懷孕​ 成績， 他們更在2012年推出qPCR ​技術2013年發表​植入2個 qPCR ​懷孕率94.7%，​ 最近最熱門的當然是 ​NGS​ 次世代定序， 所以篩檢胚胎從已經被淘汰的FISH， 到2007年~2008年的CGH、aCGH微陣列基因晶片， 2010年的SNP單核甘酸多樣性， 2012年即時定量多重酶聚合反應， 和2013年已經有報導的次世代定序， 這6個檢查胚胎染色體的平台， 我們要分胚胎頂多 ​切片​ 3個 ​胚葉​ 細胞~6個細胞， 這時候胚胎DNA的量大概只有2X負 ​12 次方到2的負10次方量， 以我們所需要檢查DNA所需要的量為2X10負6次方 ，遠遠不 ​足​ 夠因此要做基因放大，因此你要做SNP、a-CGH、NGS，都必須要透過基因放大。 我們看一下SNP、qPCR、aCGH的胚胎PK， 如果用SNP他用基因放大之後， 把檢測的胚胎和對照組使用電腦去比較DNA， 目前公認SNP是用檢查胚胎的黃金準則， 但是SNP貴又時間久要3天半， 可是它告訴我們胚胎整倍不整倍，他也一樣要做雙重， 也就是說檢查胚胎需要對照組胚胎正常的染色體， 那如果是aCGH一樣經過PCR基因放大， 但是他釋放在一個基因晶片上面， 檢測的DNA和對照組的DNA去做競爭， 所以CGH的C就是競爭， aCGH出來的曲線就像是股票的曲線有高、有低， 高出來的就是多一套染色體 低下去的就是少一套染色體， 最新的是NGS次世代定序相較於傳統基因定定序的好處是大量平行性的定序， 大可以取得3個資訊： 1.胚胎的染色體、 2單基因疾病、 3.粒線體的基因突變， NGS次世代定序一樣需要把DNA做放大， 兩倍再結合， 在跟對照組DNA這個需要電腦去做判讀， 但出來的訊號非常的複雜，需要用software ​程式​ 去做annalysis。 2013年已經有4篇NGS ​用在PGS​ 在美國生殖醫學會ASRM ​年會​ 去做發表， 包括1份海報、3份口頭報告， 其中注意來自於義大利羅馬團隊，口頭報告270篇他對次世代定序驗證， CCS胚胎著床前染色體檢查要用到病人身上前，一定要做臨床的驗證validation。 2012年的qPCR做胚胎的囊˙胚切片， 經過高溫分離兩股DNA， 在放到qPCR的儀器96、384、1536 wells ， 經過分析只要4個小時， 有快、便宜、彈性的好處， 而且不用全基因放大， 他只需要的設計定點放大， 2012年經過Nathan Treff ​(​ RMANJ ​)​ 驗證後2013年發表臨床的應用， qPCR如果某段基因多或少就會在儀器上顯示出不同的顏色， 比如說這張qPCR圖 (fig-1)16對染色體、21對染色體多了唐氏症，就會呈現淺黃色，因為它的染色體數目是多了， 反觀如果在在性染色體X或Y是紅色，因為他染色體只有1套，所以可以很清晰看到16.、21染色體是3套，再用2008年的一份公式去算， 經過電腦分析可以算出和aCGH一樣、 和SNP一樣，多出來看的出來。 在臨床上做CCS一定要有3個特點： 1.臨床前要很準確。 2.做切片不傷到胚胎也就是安全。 3.臨床上要有它的有效性， 比如說 有疾病要找 ​疾病的胚胎​ 出來， 沒有疾病的要增加胚胎著床率、懷孕率，這叫有效。 我們把SNP、qPCR、aCGH來做對比， 發現SNP很準確，都有98.6%的正確率， 那qPCR呢？有97.6%，兩者差不多， 如果胚胎用qPCR、SNP，發現他們報告幾乎是很吻合， 98.6%是吻合多很高的， 當然用以前老舊的方法FISH和SNP去做對比，SNP一下子就把FISH打敗， 臨床上第3天切片和第5天切片，會有第3天切片減少39%著床率。 那我們怎麼去預測這個檢測方法的臨床價值， 也就是診斷正確不傷胚胎而且要增加懷孕率， 在預測第3天切片的準確度， CCS的陽性預測率也就是胚胎正常，後來也是正常，大概在29.2%到18%， 第3天胚胎是29.2%， 第5天胚胎是48.2%， 那如果說是這胚胎染色體是異常第3天是98.1%， 第5天是93.5%的正確率， 這個數據顯示第3天切片是有胚胎染色體鑲嵌的風險， 有一個研究找來55個囊胚， 先經由aCGH證明染色體的異常， 再切一次用qPCR， qPCR說這裡面有48個異常， 但是有7個他認為正常， 這7個用SNP來做公正裁判， 發現有5個和qPCR看法一致， 但是有2個3個檢查是不一致， ​TREFF​ 由此可見可以做出一個結論 : qPCR比aCGH更準確， 在這個優越的基礎上， 2013年義大利團隊做出來的口頭論文， 在他們發表幻燈片上面同一個胚胎， SNP和qPCR都認為46XY正常， aCGH卻是說它是45XY， 第8對染色體少一根，顯見qPCR比aCGH準確，因此在SNP、qPCR和aCGH， 尤其qPCR和aCGH上， 我們發現qPCR錯誤率是0， 但aCGH錯誤率是9%， 這兩個是有統計學上的差異， 當你有兩個胚胎3個檢查看法不一致。 那什麼情況下病人要用CCS？ 當然胚胎的安全是第一要務， 也就是說你切下去不會傷到胚胎， 請記得那時候有一個倫敦血友病是 ​在 胚胎第3天胚胎片， 用 ​男女​ 性別去區分有或沒有 ​血友病​ ，那是1990年翰迪賽 ​HANDYSIDE​ ， 那是人類第一個PGD成功的案例， 1967年是兔子的胚胎， 可是第3天切片會傷到胚胎， 而哪一切片才不會傷到胚胎？ 有一個數據可能會讓你嚇了一跳，在2010年歐洲生殖醫學會統計有申報的胚胎切片案例，2萬1千794個都是第3天切片，只有58個是 ​第五天​ 囊胚期胚胎切片，那是4年前的事情，但是現在的證據顯示，尤其是2013年紐澤西團隊思考特他發現第3天胚胎切片著床率少了39%，第5天不會，這份報告數據出來豈不是把2010年歐洲生殖醫學會狠狠打 ​臉 。 臨床上CCS一定要有他的有效性，而且你說有效一定要有數據顯示，醫學上就是要有隨機的臨床對比，第1份的RCT的報告顯示用單一胚胎著床率有做CCS是80%，沒有做是61%，而活產率有做的是64%沒有做的是48%，這有統計學上的差別，在2013年的72個qPCR，24條染色體的分析，植入2個胚胎，臨床懷孕率94.7%、活產率84.7%，相較於兩個胚胎沒有做切片。 囊胚外觀正常活產率68%，同樣的在2012年佛曼的研究，小於35歲做CCS他植入1個胚胎活產率是71.4%，沒有做切片47.2%，如果1個有做切片，相當於兩個沒有做切片的活產率，活產率65%，這是第2份RCT的研究，但是單胞胎的比率一個有做切片100%單胞胎，兩個沒有做切片的46%雙胞胎、2%3胞胎，植入兩個胚胎變成3胞胎，這個對於減少多胞胎是有意義的。 ​RMANJ的​ Nathan Treff納森催夫做出7點結論： 1. qPCR based CCS要有正確性，經過雙盲的研究證實那是正確的。 2.qPCR based CCS是穩定的也就是不管怎麼做他是固定的準確率和懷孕率。 3. qPCR based CCS可以可以可以看染色體也可以看單基因疾病平衡轉位。 4.qPCR based CCS是安全的不傷胚胎。 5.qPCR based CCS是有效的改善提高懷孕率。 6.qPCR based CCS他是有效的放一個胚胎而不影響懷孕率。 7.催夫認為至少在他們RMANJ 是廣泛的應用。 在2012年紐澤西團隊他們PGD案例是25%， 2013年是32%， 紐澤西團隊他們試管嬰兒一年是2000個週期， 未來的CCS無疑是次世代定序，兩個理由： 1.便宜、 2他同時也可以看單基因疾病， 一個病人他有單基因疾病如多囊腎， 第5天切片既可以看多囊腎又可以看24個染色體， 目前所有的平台只有次世代定序是可以看到。 博元婦產科

 

qPCR  based  CCS比 aCGH更準確  !! 

​    ​

 CCS胚胎染色體的 

​​

 全基因檢測6種PGS 平台  大PK:FISH  CGH   aCGH  qPCR  SNP   NGS :qPCR  based  CCS比 aCGH更準確  !!

全世界第一例試管嬰兒在1978年誕生叫路 

​意

 

​絲

 布朗，

但事實上在更早1967年艾德華就用兔子的胚胎去做公兔、母兔 

​的性別​

 PGD，

這個實驗還比試管嬰兒提早了11年，

試管嬰兒也2010年得到諾貝爾醫學獎，

公認 

​試管嬰兒​

 成就比入類登陸月球還大，

但我們面臨的是 

​女人​

 隨著年紀的增加，胚胎或卵子的染色體異常比率會增加，尤其是 

​女人​

 超過35歲以後， 

​染色體

 3套體比率像沖天炮一樣沖到35%以上，

這個研究證實年紀愈大胚胎3套體的比率會增加，

美國CDC的統計也發現年紀超過35歲以上，試管嬰兒成功率活產率也愈來愈低，尤其是超過42歲幾乎是 

​個

位數，這是2010年的統計。

從2001年到2010年美國這10年來植入胚胎數， 

​統計​

 從 

​植入胚胎​

 1個、2個、3個或4個以上，尤其是植入4個胚胎或超過4個，從 

​2001年的​

 12%降到 

​2010年的​

 1%，

可見美國在沒有人工生殖法的限制下，即便是在2010年， 

​仍然有​

 1% 

​(1600個)​

   

​植入​

 4個胚胎以上， 

​美國1年16萬次試管嬰兒，​

6%  

​植入​

 3個胚胎，

75%  

​植入​

 2個胚胎，

​植入​

 單一胚胎只有19%，

因為胚胎植入數增加，使得新生兒合併症 

​：​

 早產或低體重

​單

 胞胎是11.7%，

雙胞胎是59.4%，

​三

 胞胎高達96.1%會早產。

在2007年(民國96年)之前人類對於胚胎染色體篩檢檢查，

那一年美國生殖醫學會指導綱領提出目前的醫學證據不 

​支持

 例行性的使用PGS，

這是 

​2007

 年的事情，

那時候是第3天切片使用FISH，

那一年也提出了叫做 

​有名的：​

 莫生布魯克爭議，

其中最主要的是第三天胚胎會減少懷孕率，

 

但是這7年當中變化太大，如2008年的基因晶片a-CGH，

2009年Simon  Fishel 

​費雪​

 第1例 

​a​

 CGH寶寶誕生，

美國紐澤西團隊在2010年使用SNP，冷凍胚胎獲得驚人的 

​懷孕​

 成績，

他們更在2012年推出qPCR 

​技術2013年發表​植入2個

 qPCR 

​懷孕率94.7%，​

最近最熱門的當然是 

​NGS​

 次世代定序，

所以篩檢胚胎從已經被淘汰的FISH，

到2007年~2008年的CGH、aCGH微陣列基因晶片，

2010年的SNP單核甘酸多樣性，

2012年即時定量多重酶聚合反應，

和2013年已經有報導的次世代定序，

這6個檢查胚胎染色體的平台，

 

我們要分胚胎頂多 

​切片​

 3個 

​胚葉​

 細胞~6個細胞，

這時候胚胎DNA的量大概只有2X負 

​12

 次方到2的負10次方量，

以我們所需要檢查DNA所需要的量為2X10負6次方

，遠遠不 

​足​

 夠因此要做基因放大，因此你要做SNP、a-CGH、NGS，都必須要透過基因放大。

我們看一下SNP、qPCR、aCGH的胚胎PK，

如果用SNP他用基因放大之後，

把檢測的胚胎和對照組使用電腦去比較DNA，

目前公認SNP是用檢查胚胎的黃金準則，

但是SNP貴又時間久要3天半，

可是它告訴我們胚胎整倍不整倍，他也一樣要做雙重，

也就是說檢查胚胎需要對照組胚胎正常的染色體，

那如果是aCGH一樣經過PCR基因放大，

但是他釋放在一個基因晶片上面，

檢測的DNA和對照組的DNA去做競爭，

所以CGH的C就是競爭，

aCGH出來的曲線就像是股票的曲線有高、有低，

高出來的就是多一套染色體

低下去的就是少一套染色體，

最新的是NGS次世代定序相較於傳統基因定定序的好處是大量平行性的定序，

大可以取得3個資訊：

1.胚胎的染色體、

2單基因疾病、

3.粒線體的基因突變，

NGS次世代定序一樣需要把DNA做放大，

兩倍再結合，

在跟對照組DNA這個需要電腦去做判讀，

但出來的訊號非常的複雜，需要用software 

​程式​

 去做annalysis。

2013年已經有4篇NGS 

​用在PGS​

 在美國生殖醫學會ASRM 

​年會​

 去做發表，

包括1份海報、3份口頭報告，

其中注意來自於義大利羅馬團隊，口頭報告270篇他對次世代定序驗證，

CCS胚胎著床前染色體檢查要用到病人身上前，一定要做臨床的驗證validation。

2012年的qPCR做胚胎的囊˙胚切片，

經過高溫分離兩股DNA，

在放到qPCR的儀器96、384、1536  wells ，

經過分析只要4個小時，

有快、便宜、彈性的好處，

而且不用全基因放大，

他只需要的設計定點放大，

2012年經過Nathan  Treff  

​(​

  RMANJ 

​)​

  驗證後2013年發表臨床的應用，

qPCR如果某段基因多或少就會在儀器上顯示出不同的顏色，

比如說這張qPCR圖 (fig-1)16對染色體、21對染色體多了唐氏症，就會呈現淺黃色，因為它的染色體數目是多了，

反觀如果在在性染色體X或Y是紅色，因為他染色體只有1套，所以可以很清晰看到16.、21染色體是3套，再用2008年的一份公式去算，

 

經過電腦分析可以算出和aCGH一樣、

和SNP一樣，多出來看的出來。

在臨床上做CCS一定要有3個特點：

1.臨床前要很準確。

2.做切片不傷到胚胎也就是安全。

3.臨床上要有它的有效性，

比如說

有疾病要找 

​疾病的胚胎​

 出來，

沒有疾病的要增加胚胎著床率、懷孕率，這叫有效。

我們把SNP、qPCR、aCGH來做對比，

發現SNP很準確，都有98.6%的正確率，

那qPCR呢？有97.6%，兩者差不多，

如果胚胎用qPCR、SNP，發現他們報告幾乎是很吻合，

98.6%是吻合多很高的，

當然用以前老舊的方法FISH和SNP去做對比，SNP一下子就把FISH打敗，

臨床上第3天切片和第5天切片，會有第3天切片減少39%著床率。

那我們怎麼去預測這個檢測方法的臨床價值，

也就是診斷正確不傷胚胎而且要增加懷孕率，

在預測第3天切片的準確度，

CCS的陽性預測率也就是胚胎正常，後來也是正常，大概在29.2%到18%，

第3天胚胎是29.2%，

第5天胚胎是48.2%，

那如果說是這胚胎染色體是異常第3天是98.1%，

第5天是93.5%的正確率，

這個數據顯示第3天切片是有胚胎染色體鑲嵌的風險，

有一個研究找來55個囊胚，

先經由aCGH證明染色體的異常，

再切一次用qPCR，

qPCR說這裡面有48個異常，

但是有7個他認為正常，

這7個用SNP來做公正裁判，

發現有5個和qPCR看法一致，

但是有2個3個檢查是不一致，

​TREFF​

 由此可見可以做出一個結論  :  qPCR比aCGH更準確，

在這個優越的基礎上，

2013年義大利團隊做出來的口頭論文，

在他們發表幻燈片上面同一個胚胎，

SNP和qPCR都認為46XY正常，

aCGH卻是說它是45XY，

第8對染色體少一根，顯見qPCR比aCGH準確，因此在SNP、qPCR和aCGH，

尤其qPCR和aCGH上，

我們發現qPCR錯誤率是0，

但aCGH錯誤率是9%，

這兩個是有統計學上的差異，

當你有兩個胚胎3個檢查看法不一致。

那什麼情況下病人要用CCS？

當然胚胎的安全是第一要務，

也就是說你切下去不會傷到胚胎，

請記得那時候有一個倫敦血友病是 

​在

 胚胎第3天胚胎片，

用 

​男女​

 性別去區分有或沒有 

​血友病​

 ，那是1990年翰迪賽 

​HANDYSIDE​

 ，

那是人類第一個PGD成功的案例，

1967年是兔子的胚胎，

可是第3天切片會傷到胚胎，

而哪一切片才不會傷到胚胎？

有一個數據可能會讓你嚇了一跳，在2010年歐洲生殖醫學會統計有申報的胚胎切片案例，2萬1千794個都是第3天切片，只有58個是 

​第五天​

 囊胚期胚胎切片，那是4年前的事情，但是現在的證據顯示，尤其是2013年紐澤西團隊思考特他發現第3天胚胎切片著床率少了39%，第5天不會，這份報告數據出來豈不是把2010年歐洲生殖醫學會狠狠打 

​臉

 。

臨床上CCS一定要有他的有效性，而且你說有效一定要有數據顯示，醫學上就是要有隨機的臨床對比，第1份的RCT的報告顯示用單一胚胎著床率有做CCS是80%，沒有做是61%，而活產率有做的是64%沒有做的是48%，這有統計學上的差別，在2013年的72個qPCR，24條染色體的分析，植入2個胚胎，臨床懷孕率94.7%、活產率84.7%，相較於兩個胚胎沒有做切片。

囊胚外觀正常活產率68%，同樣的在2012年佛曼的研究，小於35歲做CCS他植入1個胚胎活產率是71.4%，沒有做切片47.2%，如果1個有做切片，相當於兩個沒有做切片的活產率，活產率65%，這是第2份RCT的研究，但是單胞胎的比率一個有做切片100%單胞胎，兩個沒有做切片的46%雙胞胎、2%3胞胎，植入兩個胚胎變成3胞胎，這個對於減少多胞胎是有意義的。

​RMANJ的​

 Nathan  Treff納森催夫做出7點結論：

1. qPCR based  CCS要有正確性，經過雙盲的研究證實那是正確的。

2.qPCR based  CCS是穩定的也就是不管怎麼做他是固定的準確率和懷孕率。

3. qPCR based  CCS可以可以可以看染色體也可以看單基因疾病平衡轉位。

4.qPCR based  CCS是安全的不傷胚胎。

5.qPCR based  CCS是有效的改善提高懷孕率。

6.qPCR based  CCS他是有效的放一個胚胎而不影響懷孕率。

7.催夫認為至少在他們RMANJ 是廣泛的應用。

在2012年紐澤西團隊他們PGD案例是25%，

2013年是32%，

紐澤西團隊他們試管嬰兒一年是2000個週期，

未來的CCS無疑是次世代定序，兩個理由：

1.便宜、

2他同時也可以看單基因疾病，

一個病人他有單基因疾病如多囊腎，

第5天切片既可以看多囊腎又可以看24個染色體，

目前所有的平台只有次世代定序是可以看到。

 

 

 

 

 

 

博元婦產科